Image processing for seed stainability detection through tetrazolium test

مقدمه

تعیین قوه‏نامیه بذر، یکی از مهم‏ترین اقدامات برای بررسی ویژگی‏های بذر به‏ویژه قابلیت جوانه‏زنی می‏باشد. آزمون‌های جوانه‌زنی و بیوشیمیایی، کشت‌جنین و استفاده از اشعه ایکس، از روش‏هایی هستند که به‏برای سنجش توانایی زنده‌مانی بذرها استفاده می‏شود (Van Mourik, 2003) و از بین این روش‌ها، آزمون‏های بیوشیمیایی یکی از سریع‏ترین روش‏ها برای تعیین قوه‏نامیه بذر ‏است (Van Mourik, 2003). آزمون تترازولیوم (Tetrazolium test) به‌عنوان یک روش بیوشیمیایی برای کنترل کیفیت بذر گونه‏های مختلف گیاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد و به‌صورت گسترده، برای تشخیص قوه نامیه بذر استفاده می‌شود (ISTA, 2003). این آزمون در اوایل دهه 1940 در آلمان توسعه یافت و سپس در ایالات متحده پس از جنگ جهانی دوم معرفی شد (Vankus, 1997). یکی از دلایل استفاده گسترده از این آزمون، سرعت انجام آن (چند ساعت) در تعیین میزان قابلیت زنده‌مانی بذر است. سازوکار انجام آزمون تترازولیوم بدین صورت است که به هنگام تنفس بافت زنده بذر، نمک تتررازولیوم کلرید یا برومید بی‏رنگ به تری‌فنیل‌فورمازان قرمز رنگ تغییر می‌یابد که این عمل از طریق آزاد شدن یون هیدروژن در اثر فعالیت آنزیم دی‌هیدروژناز صورت می‏گیرد که سبب احیای (کاهش) نمک بی‌رنگ تترازولیوم و تبدیل آن به فورمازان قرمزرنگ می‏شود؛ به عبارتی دیگر، این واکنش، رنگیزه‌های نامحلول در آب با نام فرمازان را که در سلول‌های زنده تشکیل شده‌اند را از حالت بی‌رنگ خارج می‌کند و به رنگ قرمز درمی‌آورد، اما سلول‌های مرده به همان حالت بی‌رنگ باقی می‌مانند و تغییری در آن‌ها مشاهده نمی‌شود و بدین ترتیب، بذر زنده از بذر مرده متمایز می‌شوند (Vankus, 1997). چنانچه جنین و احتمالاً آندوسپرم یا مواد ثانویه ذخیره شده یا باقی‏مانده به‌طور فعال تنفس‌کنند، فرمازان موجود خواهد بود و بافت‌ها رنگ پایدار قرمز به خود می‌گیرند (Vankus, 1997). بر این اساس، قوه‌نامیه بذر  از طریق ارزیابی مقدار ناحیه رنگ‌آمیزی شده و شدت آن تعیین می‌شود.

گرچه انجام آزمون تترازولیوم نسبت به سایر آزمون‌های تشخیص قوه‏نامیه، دقیق‌تر و نیازمند زمان کم‌تری می‌باشد، اما چنانچه حجم نمونه‌های مورد آزمون بسیار زیاد باشد، یک آزمون زمان‌بر به‏شمار می‏آید و به تخصص و تجربه بالا در تفسیر میزان رنگ‌پذیری و تعیین درصد قوه‏نامیه بذرها نیاز دارد. بدین دلیل در بسیاری از موارد، عدم مهارت کافی در تفسیر میزان رنگ‌پذیری و احتمال وقوع خطا در میزان شمارش تعداد بذرهای تیمار شده می‌تواند سبب بروز خطا در انجام این آزمون شود (Vankus, 1997). در سال‌های اخیر، روش‌های مبتنی بر ارزیابی رایانه‌ای با بهره‏گیری از تصاویر گرفته شده از بذرها به‏منظور تعیین قوه‏نامیه بذرها در آزمایش جوانه‌زنی مورد استفاده قرار گرفته‌اند (Marcos-Filho et al., 2006). طبق گزارش گومزجونیور و همکاران (Gomes-Junior et al., 2009) نتایج و بررسی تصایر با استفاده از رایانه در مقایسه با روش‏های مرسوم تعیین قوه‏نامیه بذر ساده‌تر به‏نظر می‏رسد.

کاربرد فن‌آوری‏های جدید از جمله روش پردازش تصویر می‌تواند منجر به کاهش خطا در تجزیه و تحلیل نتایج شود. بهتاری و همکاران (Behtari et al., 2014) گزارش کردند که استفاده از سیستم پردازش تصویر با روش RGB به‏منظور تعیین قوه‏نامیه در دو گونه یونجه (Medicago sativa L.) و اسپرس (Onobrychis viciifolia L.)، یک روش عملی و دقیق به‌منظور تعیین کیفیت یا قوه‏نامیه بذر در این گیاهان است و می‏تواند برای بسیاری از گیاهان نیز مورد استفاده قرار گیرد، به‏طوری‌که براساس نتایج این پژوهش، روش RGB می‏تواند خیلی دقیق‏تر و آسان‏تر از روش مشاهده‏ چشمی، بذرهای دارای قوه‏نامیه و بدون قوه‏نامیه دو گونه فوق را از هم تشخیص دهد. نتایج بررسی قوه‏نامیه بذر گیاه کاهو (Lactuca sativa L.) با پردازش تصویر و ارزیابی با روش RGB نشان داد که بذرهایی که پوسته روشن و اندازه کوچکی دارند، در مقایسه با بذرهای درشت و رنگ پوسته تیره‏تر، درصد قوه‏نامیه یا رنگ‏پذیری کمتری دارند (Peñaloza et al., 2005).

یکی از مشکلات آزمون‌ تترازولیوم در روش‏های معمول برای تعیین میزان زنده‌مانی بذر، وابستگی کامل این روش‌ها به تشخیص فرد خبره است؛ بنابراین، این آزمایش با هدف ارزیابی توانایی روش پردازش تصویر در تفسیر نتایج آزمون تترازولیوم و مقایسه آن با روش‏ ارزیابی چشمی (روش مرسوم ارزیابی توسط کاربر) انجام شد.

مواد و روش‏ها

به‏منظور تعیین قوه‏نامیه بذرها قبل از اجرای آزمایش، آزمون جوانه‏زنی استاندارد انجام شد. از آن‌جا که آزمون تترازولیوم، وابسته به روش تیماری، شرایط آزمایش و گونه گیاهی است، در پژوهش حاضر بذر علف‏هرز پهن‌برگ ماشک گل‏خوشه‎ای (Vica villosa Roth.) و گیاه زراعی باریک برگ گندم (Triticum aestivum L.) برای بررسی توانایی پردازش تصویر در ارزیابی نتایج آزمون تترازولیوم به کار گرفته شد. این آزمایش در سال 1397 در آزمایشگاه گروه مکانیک بیوسیستم دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس به‌صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی و با سه تکرار انجام شد. فاکتورهای آزمایش عبارت بودند از: 1) روش‌های تشخیص قوه‏نامیه شامل سه روش چشمی، RGB و Lab، 2) نوع گیاه شامل دو گیاه گندم و ماشک‏گل‏خوشه‏ای، 3) روش‌های خراش‌دهی فیزیکی شامل پنج روش برش‏عرضی و ‏طولی، سمباده‏زنی، سوزن‏زنی و شاهد بدون تیمار فیزیکی و 4) مدت زمان قرارگیری در تترازولیوم در دو سطح10 و 24 ساعت بودند. بذر هریک از گونه‏ها (30 عدد) روی کاغذ صافی در پتری‌دیش‏های با قطر نُه سانتی‏متر قرار گرفتند و حدود 10 میلی‏لیتر آب مقطـر به آن‌ها افزوده شد. سپس پتری‏دیش‏های حاوی بذر در دمای اتاق (2±25 درجه سانتی‏گراد) و شرایط 16 ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی قرار داده شدند. شمارش بذرهای جوانه‏دار هر روز حداقل دو مرتبه انجام شد و بذرهای جوانه‌زده (اندازه ریشه‏چه به طول یک میلی‏متر) حذف شدند؛ شمارش تا زمانی که سه روز متوالی جوانه‏زنی مشاهده نشد، ادامه یافت. در نهایت میانگین درصد جوانه‏زنی گندم و ماشک که به‏ترتیب 96 و 67/85 درصد بود، به‌دست آمد.

پس از اطمینان از سالم بودن بذرها، به‏منظور تعیین قوه‏نامیه بذرها از آزمون تترازولیوم یک درصد استفاده شد. برای این منظور، 30 عدد بذر از هر گونه به مدت 14 ساعت در داخل آب مقطر خیسانده شدند. برای تهیه محلول تترازولیوم، ابتدا 70/2 گرم از ماده پتاسیم دی‌هیدروژن فسفات (KH₂PO₄) در 250 میلی‏لیتر آب (محلول شماره یک) و 37/2 گرم از دی سدیم هیدروژن فسفات (Na₂HPO₄) در 250 میلی‏لیترآب (محلول شماره دو) حل شد. سپس 100 میلی‏لیتر از محلول شماره یک به 150 میلی‏لیتر از محلول شماره دو اضافه شد. در نهایت 250 میلی‏لیتر محلول بافر حاصل با یک گرم نمک تترازولیوم (3و3و2- تری‌فنیل‌تترازولیوم کلراید (TTC) محصول شرکت مرک (Merck) آلمان) ترکیب شد. به‏منظور رنگ‏پذیری بهتر بذرها، پس از سپری شدن مرحله آبنوشی (14 ساعت در آب مقطر در دمای اتاق)، تیمارهای خراش‌دهی فیزیکی مختلف شامل برش‏عرضی و ‏طولی، خراش‏دهی با سمباده و سوزن‏زنی روی بذرهای این دو گونه گیاهی در سه پتری‏دیش (سه تکرار) اعمال شد و سپس در تاریکی در دمای 20-25 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند. پس از اعمال تیمارهای فیزیکی، بذر‌ها در داخل محلول تترازولیوم در دو مدت زمان (10 و 24 ساعت) نگهداری شدند. به‏منظور ارزیابی قوه‏نامیه بذرها، ابتدا تصاویر بذرهای داخل هر پتری‌دیش با استفاده از دوربین مدل Logitechc920 (دوربین در داخل یک جعبه مخصوص تعبیه شده بود) تهیه شد و سپس ارزیابی به روش چشمی نیز انجام شد. در واقع برای تعیین تعداد و کیفیت بذرهای رنگ‏گرفته، از سه روش مشاهده چشمی (شمارش رنگ‏پذیری بذرها توسط سه فرد متخصص)، فضای رنگی RGB و  فضای رنگی Lab استفاده شد. فضای رنگی RGB از سه مولفه رنگی قرمز، سبز و آبی تشکیل شده است که هر کدام بـین مقـادیر صفر تـا 255 تغییـر می‏کند. هر پیکسل (کوچکترین واحد تشکل دهنده تصویر) رنگی در تصاویر RGB دارای مقدار مشخصی از رنگ قرمز، سبز و آبی اسـت (Gonzalez et al., 2002). همچنین فضای رنگی Lab از سه مولفه *L معادل روشنایی، مولفه *a دامنه رنگ از سبز به قرمز و مقادیر *b دامنه رنگ از زرد به آبی است (Chaudhary et al., 2012). در این روش‏ها بعد از گرفتن تصاویر با دوربین، تصاویر در داخل نرم‏افزار Matlab آستانه‌گذاری شدند و مؤلفه R و a به‏ترتیب از روش‏های RGB (آستانه از صفر-255) و Lab (آستانه‏گذاری از صفر -30) محاسبه شدند. بعد از محاسبه مؤلفه‏ها و به‏منظور رسم نمودارها، همه داده‏ها بر اساس درصد که همان واحد ارزیابی چشمی نیز می‏باشد، ارائه شدند. ارزیابی و پردازش تصاویر با استفاده از نرم افزار Matlab و آنالیز آماری داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SAS روی داده‌های مشاهده چشمی، مؤلفه R در فضای رنگی RGB و مؤلفه a در فضای رنگی Lab انجام شد و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال‏‏ آماری 05/0 و 01/0 صورت گرفت.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که همه اثرات اصلی شامل تیمارهای خراش‏دهی فیزیکی، نوع گیاه، زمان تیمار با محلول تترازولیوم و روش‏های ارزیابی قوه‏نامه بذرها روی میزان رنگ‏پذیری در سطح احتمال 01/0 معنی‏دار بود (جدول 1). همچنین علاوه بر اثرات اصلی فاکتورهای نام برده، اثر متقابل، اثر سه‌گانه و چهارگانه هر چهار فاکتور مورد بررسی نیز در سطح احتمال 01/0 درصد معنی‏دار بود.

اثر مدت زمان تیمار با تترازولیوم بر درصد رنگ‏پذیری گندم و ماشک گل خوشه‏ای

با توجه به نتایج مقایسه میانگین، تأثیر مدت زمان حضور بذرها روی رنگ‏پذیری دو گیاه گندم و ماشک ‏گل‏خوشه‏ای تقریباً یکسان بود، به‌طوری‌که در هر دو گیاه، بیشترین درصد قوه‏نامیه یا رنگ‏پذیری (60 و 41 درصد به‏ترتیب در گندم و ماشک گل‏خوشه‏ای) به تیمار حضور بذرهای این گیاهان در محلول تترازولیوم به مدت 24 ساعت تعلق داشت. (شکل 1). همچنین در هر دو گیاه، اختلاف معنی‏داری بین مدت زمان 10 و 24 ساعت حضور بذرها در تترازولیوم مشاهده شد. این نشان می‏دهد که فاکتور مدت زمان قرارگرفتن بذرها در محلول تترازولیوم می‏تواند یک عامل بسیار مهم در تعیین میزان رنگ‏پذیری و در نتیجه تشخیص قابلیت زنده‏بودن بذر باشد؛ این عامل به‏ویژه در بذرهایی که دارای پوسته سخت می‏باشند و آب به سختی در آن‏ها نفوذ می‏کند می‏تواند به خوبی در میزان رنگ‏پذیری تأثیرگذار باشد. فرانکا-نتو و همکاران (França-Neto et al., 1998) در ارزیابی قوه‏نامیه گندم با آزمون تترازولیوم در مدت زمان حداقل 24 ساعت حضور در تترازولیوم گزارش کردند که طی این مدت (زمان 24 ساعت)، بذرهای گندم بیشترین رنگ‏پذیری را نشان دادند.

جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر تیمارهای مختلف خراش‏دهی، مدت زمان تیمار با تترازولیوم، روش‏های ارزیابی قوه‏نامیه و نوع گیاه روی رنگ‏پذیری بذر

Table 1. Variance analysis of the effect of different physical treatments, duration of exposure to the tetrazolium solution, the method of identifying the stainability and plant species on the percentage of seed stainability

Ns، ^* و ^**: به‌ترتیب غیر معنی‌دار و معنی دار در سطح 05/0 و 01/0.

Ns. * and **: non-significant and Significance at 0.05 and 0.01 of probability levels, respectively.

شکل 1- درصد رنگ‏پذیری بذرهای گندم و ماشک‏گل خوشه‏ای تحت تیمار مدت زمان قرارگیری در محلول تترازولیوم.

 تیمارهای دارای حروف مشترک تفاوت معنی‏داری (p < 0.05) با یکدیگر ندارند.

Figure 1. Staining percentage of wheat and hairy vetch seeds at different exposure time to the tetrazolium solution. Treatments with the similar letters are not significantly (p < 0.05) different.

اثر تیمارهای مختلف خراش‏دهی فیزیکی بر درصد رنگ‏پذیری گندم و ماشک گل خوشه‏ای

نتایج این بخش بدون در نظر گرفتن فاکتور مدت زمان قرارگیری در محلول تترازولیوم با هدف مقایسه تاثیر بین تیمارهای مختلف فیزیکی (برش‏عرضی، برش‏طولی، سمباده‏زنی، سوزن‏زنی و شاهد بدون تیمار فیزیکی) بر میزان رنگ‏پذیری یا درصد قوه‏نامیه دو گیاه گندم و ماشک گل‏خوشه‏ای مورد ارزیابی قرار گرفت. با توجه به نتایج مقایسه میانگین، تأثیر تیمارهای خراش‏دهی روی رنگ‏پذیری دو گیاه گندم و ماشک ‏گل‏خوشه‏ای تقریباً یکسان بود، به‌طوری‌که در هر دو گیاه، بیشترین درصد قوه‏نامیه یا رنگ‏پذیری (63 و 43 درصد به‏ترتیب در گندم و ماشک گل‏خوشه‏ای) در تیمار برش‏دهی طولی مشاهده شد. همچنین کمترین میزان رنگ‏پذیری در هر دو گیاه (34 و 33 درصد به‏ترتیب در گندم و ماشک گل‏خوشه‏ای) به تیمار شاهد یا بدون اعمال تیمار خرا‎ش‏دهی تعلق داشت. تیمار برش‏دهی طولی در هر دو گیاه، اختلاف معنی‏داری با بقیه تیمارهای خراش‏دهی فیزیکی نشان دادند؛ البته در هر دو گیاه، تیمارهای برش‏دهی عرضی، سمباده‏زنی و سوزن‏زنی، اختلاف معنی‏داری با هم نداشتند و در یک گروه آماری قرار گرفتند (شکل 2).

شکل 2- درصد رنگ‏پذیری بذرهای گندم و ماشک‏گل خوشه‏ای تحت تیمارهای مختلف خراش‌دهی فیزیکی.  تیمارهای دارای حروف مشترک، تفاوت معنی‏داری با یکدیگر ندارند.

Figure 1. Staining percentage of wheat and hairy vetch seeds under different physical scarification treatments. Treatments with the similar letters are not significantly (p < 0.05) different.

مقایسه روش‏های ارزیابی رنگ‌پذیری‎ بذر گندم و ماشک گل خوشه‏ای در حضور تیمارهای مختلف خراش‏دهی فیزیکی بدون در نظر گرفتن زمان حضور بذر‏ها در تترازولیوم

نتایج مقایسه میانگین تأثیر تیمارهای خراش‏دهی فیزیکی (برش‏عرضی و ‏طولی، سمباده‏زنی، سوزن‏زنی و شاهد) بر میزان رنگ‏پذیری بذر گندم و ماشک ‏گل‏خوشه‏ای با توجه به سه روش ارزیابی رنگ‏پذیری بذر شامل روش Lab (مؤلفه A)، روش RGB (مؤلفه R) و روش ارزیابی چشمی (E) نشان داد که بیشترین رنگ‏پذیری بذر در هر سه روش ارزیابی، در تیمار برش‏دهی طولی مشاهده شد. تیمار برش‏دهی طولی بذر گندم بر اساس سه روش ارزیابی با سایر تیمار‏ها روی این گونه اختلاف معنی‏داری داشت. میزان رنگ‏پذیری بذر گندم با اعمال تیمار برش‏دهی طولی بر اساس روش‏های ارزیابی چشمی، Lab وRGB  به‏ترتیب 55، 57، 77 درصد بود. از این نظر، روش RGB با دور روش ارزیابی چشمی و روش Lab متفاوت بود و دو روش آخر در یک گروه آماری قرار گرفتند (شکل 3).

شکل 3- مقایسه روش‏های ارزیابی چشمی (E)، روش RGB (R)  و روشLab (A) رنگ‌پذیری بذر گندم تیمار شده با تترازولیوم با اعمال تیمارهای مختلف فیزیکی شامل برش‏طولی و ‏عرضی، سمباده‏زنی، سوزن‏زنی و شاهد (بدون تیمار فیزیکی). تیمارهای دارای حروف مشترک تفاوت معنی‏داری با یکدیگر ندارند.

Figure 3. Comparison of the stainability methods of wheat seeds treated with tetrazolium including visual assessemnt method (E), RGB method (R), and Lab method (A) by applying different physical treatments including longitudinal cutting, cross-cutting, sanding, needling, and control (without physical treatment). Columns with similar letters are not significantly (p < 0.05) different.

لازم به ذکر است که از آن‌جا که نتایج درصد رنگ‌پذیری بذر گندم در روش RGB  (75درصد) به درصد جوانه‏زنی گندم (96 درصد) نزدیک بود، بنابراین می توان روشRGB  را نیز به‌عنوان روش مطلوب در نظر گرفت (شکل 3). مقایسه 15 تیمار اثرگذار در رنگ‏پذیری بذر گندم نشان داد که کمترین رنگ پذیری به تیمار کنترل یا شاهد در روش ارزیابی چشمی با درصد رنگ‏پذیری 28/13 تعلق داشت که از نظر آماری با سایر تیمارها تفاوت معنی‏داری نشان داد. تیمارهای برش‏دهی عرضی، سوزن‏زنی و سمباده‏زنی در روش ارزیابی RGB  با رنگ‏پذیری حدود 69 درصد، تفاوت معنی‏داری با بقیه تیمارها نشان دادند، ولی با یکدیگر در یک گروه آماری قرار گرفتند. این سه تیمار در روش RGB  پس از تیمار برش‏دهی طولی مربوط به همین روش ارزیابی، بیشترین رنگ‏پذیری را در مقایسه با سایر تیمارها داشتند. همچنین تیمارهای برش‏دهی عرضی و سوزن‏زنی در روش ارزیابی Lab، با تیمارهای برش‏دهی عرضی و سوزن‏زنی در روش ارزیابی چشمی از نظر آماری تفاوت معنی‏داری باهم نداشتند و در یک گروه آماری قرار گرفتند. علاوه بر این، تیمار برش‏دهی‏ طولی بر اساس روش‏های ارزیابی Lab  و چشمی در یک گروه آماری قرار گرفتند و اختلاف معنی‏داری با یکدیگر نشان ندادند. همچنین تیمار شاهد یا کنترل روش ارزیابی Lab با همه تیمارهای مورد بررسی در رنگ‏پذیری بذر گندم تفاوت معنی‏داری نشان داد.

 به‌طورکلی روش ارزیابی RGB  در مقایسه با روش‏های ارزیابی Lab و چشمی، درصد رنگ‏پذیری بالاتری را برای گندم نشان داد، به طوری که درصد رنگ‌پذیری در روش RGB نزدیک به درصد جوانه‏زنی بذر گندم بود؛ این موضوع می‌تواند برتری این روش را نشان دهد.

نتایج مقایسه میانگین 15 تیمار اثرگذار در رنگ‏پذیری بذر ماشک گل‏خوشه‏ای نشان داد که تأثیر تیمارها متفاوت بوده است (شکل 4). برش‏دهی طولی بذر ماشک گل خوشه‌ای، منجر به بیشترین رنگ پذیری در هر سه روش ارزیابی شد و تیمار برش‏دهی طولی در روش ارزیابی Lab با بیشترین رنگ‏پذیری (53 درصد رنگ‏پذیری)، اختلاف معنی‏داری با سایر تیمارها داشت. پس از تیمار برش‏دهی طولی، تیمار برش‏دهی عرضی در روش ارزیابی Lab با 50 درصد رنگ‏پذیری، منجر به بیشترین رنگ‏پذیری بذر ماشک گل‏خوشه‏ای شد و با سایر تیمارها نیز اختلاف معنی‏داری داشت. کمترین میزان رنگ‏پذیری در تیمارهای سمباده‏زنی و شاهد در روش ارزیابی چشمی با 15 و 13 درصد مشاهده شد که با سایر تیمارها اختلاف معنی‏داری داشتند، اما هر دو تیمار با هم در یک گروه آماری قرار گرفتند.

به‏طورکلی، روش ارزیابی Lab در مقایسه با روش‏های ارزیابی RGB  و چشمی، درصد رنگ‏پذیری بالاتری (نزدیک به جوانه‏زنی ماشک‏ گل‏خوشه‏ای) را برای بذرهای ماشک گل خوشه‌ای با برش طولی نشان داد؛ بنابراین این روش می‏تواند به‏عنوان روشی جایگزین برای روش مشاهده چشمی به‌منظور بیان درصد رنگ‏پذیری در گیاه ماشک گل‏خوشه‏ای مورد استفاده قرار گیرد. ‏

شکل 4- شکل 3- مقایسه روش‏های ارزیابی چشمی (E)، روش RGB (R)  و روشLab (A) رنگ‌پذیری بذر ماشک گل‌خوشه‌ای تیمار شده با تترازولیوم با اعمال تیمارهای مختلف فیزیکی شامل برش‏طولی و ‏عرضی، سمباده‏زنی، سوزن‏زنی و شاهد (بدون تیمار فیزیکی). تیمارهای دارای حروف مشترک تفاوت معنی‏داری با یکدیگر ندارند.

Figure 4. Comparison of the stainability methods of hairy vetch seeds treated with tetrazolium including visual assesment method (E), RGB method (R), and Lab method (A) by applying different physical treatments  including longitudinal cutting, cross-cutting, sanding, needling, and control (without physical treatment). Columns with similar letters are not significantly (p < 0.05) different.

نتیجه‌گیری کلی

نتایج نشان داد که به کمک پردازش تصویر می‌توان بذرهای با قوه‏نامیه بالا را از بذرهای با قوه‏نامیه پایین در آزمون تترازولیوم تشخیص داد. نگهداری بذرهای گندم و ماشک گل خوشه‌ای به مدت 24 ساعت در محلول تترازولیوم،  رنگ‏پذیری را نسبت به تیمار 10 ساعت افزایش داد. همچنین برش‏دهی طولی بذر گندم و ماشک‏ گل‏خوشه‏ای، رنگ‏پذیری را در مقایسه با سایر تیمارهای خراش‏دهی فیزیکی افزایش داد. هر دو روش RGB و Lab  به خوبی روش چشمی، توانایی تشخیص بذرهای رنگ گرفته را داشتند، با این حال، روش RGB برای تعیین میزان رنگ‏پذیری بذر گندم و روش‏ Lab برای تعیین میزان رنگ‏پذیری بذر ماشک گل‏خوشه‏ای بهتر بود. بر این اساس و با توجه به اهمیت زمان و زمان‌بندی در پژوهش‌های کشاورزی، روش‏های RGB و Lab می‏تواند در مقایسه با روش چشمی برای تعیین قوه‏نامیه در آزمون تترازولیوم کارآمدتر باشند.

منابع

Behtari, B., De Luis, M. and Nasab, A.D.M. 2014. Predicting germination of Medicago sativa and Onobrychis viciifolia seeds by using image analysis. Turkish J. Agric. For. 38: 615-623. ‏

Chaudhary, P., Chaudhari, A.K., Cheeran, A.N., and Godara, S. 2012. Color transform based approach for disease spot detection on plant leaf. Int. J. comput. Sci. tel. 3: 65-70.

Gonzalez R.C. 2002. Digital image processing. Second edition. Upper Saddle River, NJ, US: Prentice Hall;.

Gomes-Junior, F.G., Mondo, V.H., Cicero, S.M., McDonald, M.B. and Bennett, M.A. 2009. Evaluation of priming effects on sweet corn seeds by SVIS. Seed Technol. 31: 95-100.‏

França - Neto, J.B., Krzyzanowski, F.C. and Costa, N.P. 1998. Teste De Tetrazólio Em Sementes De Soja. Embrapa-Cnpso, Londrina, Pr. 72Pp.

ISTA, 2003. International Seed Testing Association. International Rules for Seed Testing. Working Sheets on Tetrazolium Testing, Seed Sci. Technol. 2:149.

Marcos-Filho, J., Bennett, M.A., Mcdonald, M.B., Evans, A.F. and Grassbaugh, E.M. 2006. Assessment of melon seed vigour by an automated computer imaging system compared to traditional procedures. Seed Sci. Technol. 34: 485-497.‏

Neto, J.F., Krzyzanowski, F.C. and Da Costa, N.P. 1998. O Teste De Tetrazólio Em Sementes De Soja. Embrapa – Cnpso. ‏

 Peñaloza, P., Ramirez-Rosales, G., McDonald, M.B., and Bennett, M.A. 2005. Lettuce (Lactuca sativa L.) seed quality evaluation using seed physical attributes, saturated salt accelerated aging and the seed vigour imaging system. Electron. J. Biotechnol.. 8: 0-0.‏

Van Mourik, T.A., Stomph, T.J., and Westerman, P.R. 2003. Estimating Striga hermonthica seed mortality under field conditions. Asp. Appl. Biol. 69: 187-194.‏

Vankus, V. 1997. The tetrazolium estimated viability test for seeds of native plants. In National Proceedings: Forest and Conservation Nursery associations.

[1] Different physical treatments (تیمارهای مختلف فیزیکی)

[2] The method of identifying stainability (روش‏های شناسایی رنگ‌پذیری)